在qPCR過(guò)程中，有很多小伙伴可能不太明白擴(kuò)增曲線、CT值、基線、閾值線、熔解曲線等這些名詞是什么意思，那今天就讓我們一起來(lái)看一看在去PCR過(guò)程中那些令人抓狂的曲線。

擴(kuò)增曲線：在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，熒光定量PCR儀會(huì)對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，記錄的熒光信號(hào)也不斷的累積。

擴(kuò)增曲線就是描述PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。通常見(jiàn)到的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線會(huì)有兩種展現(xiàn)形式，分別是對(duì)數(shù)圖譜和線性圖譜。

典型的擴(kuò)增曲線可以分成四個(gè)時(shí)期：基線期，指數(shù)期，線性期，平臺(tái)期。

基線期：擴(kuò)增曲線的水平部分，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物生成量的變化。

指數(shù)期：PCR“一生二，二生四，四生八”的指數(shù)型擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線起峰，該時(shí)期所有反應(yīng)試劑均有盈余，DNA聚合酶仍保持著高水平的活力，每個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物量與初始模板量符合指數(shù)關(guān)系，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，故該時(shí)期最適用于定量分析。

線性期：隨著原料的消耗、產(chǎn)物的積累、酶活的損耗等，DNA的擴(kuò)增不再呈指數(shù)擴(kuò)增，熒光信號(hào)的增長(zhǎng)也逐漸放緩，反應(yīng)效率降低，產(chǎn)物量與初始模板量不再符合指數(shù)關(guān)系。

平臺(tái)期：由于底物耗盡，酶活性降低等因素，熒光信號(hào)不再增加，趨于平穩(wěn)。由于影響PCR擴(kuò)增的因素錯(cuò)綜復(fù)雜，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間和平臺(tái)期的高低都各不相同。

基線：基線是PCR最初幾個(gè)循環(huán)的背景信號(hào)，呈現(xiàn)出起伏較小的直線形態(tài)，此時(shí)軟件能夠自動(dòng)計(jì)算出合理的基線范圍。

閾值線：閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。熒光域值設(shè)定在 PCR的指數(shù)增長(zhǎng)期。

CT值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT值

熔解曲線和Tm值：熔解曲線(Dissociation curve)是指隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線；總的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半的溫度稱為熔解溫度（Tm），不同的PCR產(chǎn)物由于GC含量，片段大小，鹽離子濃度的不同，其對(duì)應(yīng)的Tm值也不同，因此可以根據(jù)Tm值對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：通常情況下將已知濃度的樣品經(jīng)過(guò)梯度稀釋后分別取樣進(jìn)行熒光定量PCR，得到一系列的CT值，以濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)繪制曲線，即可得到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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