1992年，一位日本研究人員Higuchi提出了qPCR（Quantitative real-time PCR）技術——在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化來實時監(jiān)測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過CT值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析的一項技術。經(jīng)歷從研發(fā)到市場化，1996年，美國應用生物系統(tǒng)公司ABI推出了首臺qPCR儀。

目前，主要通過兩種方式對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤——熒光染料法與熒光探針法，既可以定量分析，也可以用來定性分析。

根據(jù)qPCR檢測系統(tǒng)所生成的數(shù)據(jù)，結合標準曲線和熔解曲線，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理就可以得到起始模板濃度。

qPCR染料法特點

染料法經(jīng)濟實惠，但是由于染料只要是雙鏈DNA就會與之結合發(fā)光，特異性不強，需要做熔解曲線觀察其特異性。

在高通量測序實驗室中（以血液樣本為例），運用核酸提取試劑盒提取出基因組DNA，再將基因組DNA打斷、拼接、重組，制備出重塑的DNA模型即基因文庫。為了對建庫產(chǎn)物進行質量檢測，應用的就是qPCR熒光染料技術，該技術屬于相對定量方法。

在PCR反應體系中，包含一對引物和一個特異性熒光探針。該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標記了一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，不發(fā)出熒光。PCR擴增時，DNA聚合酶利用酶的外切活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光。最終，被qPCR儀監(jiān)測信號并檢出。

根據(jù)熒光定量檢測系統(tǒng)生成的擴增曲線，讀取標本CT值。根據(jù)結果判斷原則，對每一個標本進行準確的結果判讀。

探針法只有在探針結合的片段才能收集信號，具有很好的特異性，但是合成探針成本較高。

目前，國內(nèi)PCR市場因為新冠疫情帶來巨大增量，行業(yè)景氣度上升。隨著疫情防控的發(fā)展，暴露出基層檢測能力不足的短板，衛(wèi)健委多次發(fā)布政策要求加強實驗室建設和增強核酸檢測能力。廣闊的市場需求和因技術快速迭代升級帶來應用范圍拓展及成本下降，以及伴隨而來的政府支持，PCR市場規(guī)?？焖僭鲩L。PCR行業(yè)居于分子診斷黃金賽道，市場規(guī)模有望長期高增。雖然數(shù)字PCR已經(jīng)出現(xiàn)，但目前在臨床應用上仍處于探索階段。所以，qPCR技術在未來分子診斷市場中仍然扮演重要角色。