細(xì)胞凍存是指將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，以達(dá)到減少細(xì)胞代謝的作用，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存進(jìn)行保種的目的，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)或臨床使用。
目前，細(xì)胞凍存主要的技術(shù)為液氮冷凍法，實(shí)際凍存過程中，需要進(jìn)行梯度溫度凍存，并加入適量的保護(hù)劑以保證細(xì)胞內(nèi)外的水分不會(huì)形成冰晶造成細(xì)胞的損傷或死亡。
在準(zhǔn)備冷凍靶細(xì)胞之前，必須確保細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，這可以通過以下指標(biāo)進(jìn)行觀察：
培養(yǎng)基的顏色可以指示細(xì)胞是否過度生長(zhǎng)（例如，如果細(xì)胞是黃色，則表示它們過度生長(zhǎng)）；介質(zhì)的渾濁度通常表明存在污染，不適合冷凍。
通常，建議將新恢復(fù)的細(xì)胞冷凍約兩周。如果細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)月以上，性狀率會(huì)發(fā)生一些變化，此時(shí)的細(xì)胞不適合冷凍。
在凍存過程中，每只凍存管內(nèi)細(xì)胞最佳濃度為5x10^6個(gè)/ml—1x10^7個(gè)/ml，高密度或低密度對(duì)細(xì)胞存活率有一定影響。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量不足時(shí)，不建議冷凍細(xì)胞。
在細(xì)胞被消化和離心后，去除上清液并收集細(xì)胞沉淀，它們通常需要用冷凍保存液再次懸浮并轉(zhuǎn)移到冷凍保存管中。凍存液中一般含有滲透型的保護(hù)液如甘油或10%的二甲基亞砜（DMSO）和10%-90%胎牛血清。
細(xì)胞內(nèi)外的主要成分是水。如果細(xì)胞在沒有保護(hù)溶液的情況下直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水會(huì)凝結(jié)成冰晶，對(duì)細(xì)胞造成內(nèi)源性的機(jī)械損傷。細(xì)胞內(nèi)的水凝結(jié)引起的細(xì)胞脫水也會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)pH值的變化、蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞內(nèi)部器官功能的喪失，甚至細(xì)胞核內(nèi)的DNA損傷，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
而凍存液往往都是易溶解的小分子物質(zhì)，具有細(xì)胞滲透性，可以穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低冰點(diǎn)，同時(shí)又可以提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，使得細(xì)胞內(nèi)水分滲出到細(xì)胞外，從而減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。
*一些特殊的細(xì)胞，如原代皮膚細(xì)胞，會(huì)額外添加表面保護(hù)劑，如海藻糖，以提高細(xì)胞存活率。
*由于DMSO對(duì)大部分細(xì)胞無毒性作用，因此廣泛用于細(xì)胞冷凍保存；還有一些細(xì)胞，一些細(xì)胞對(duì)二甲基亞砜的毒性敏感，甘油可以用作冷凍保護(hù)劑。
冷凍保存液的另一個(gè)主要成分是胎牛血清。由于冷凍保存中的細(xì)胞代謝仍然很弱，向冷凍保存液中添加血清可以為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。同時(shí)，富含血清的蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)可以更好地保護(hù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，低溫保存液中高比例的血清有利于提高細(xì)胞活力。因此，90%的血清加10%的保護(hù)液可用于冷凍期間的細(xì)胞保存。對(duì)于常見的易于培養(yǎng)的細(xì)胞系，10%-20%的血清加上一定量的完整培養(yǎng)基和DMSO也能很好地保存細(xì)胞。
細(xì)胞冷凍保存過程是一個(gè)梯度冷卻過程，液氮是細(xì)胞最終保存的最佳冷凍介質(zhì)。液氮的溫度可以低至-196℃。在這種低溫條件下，細(xì)胞保存理論上是永久的。
緩慢冷凍過程可以使細(xì)胞內(nèi)的水在冷凍前滲出細(xì)胞形成冰晶，因此梯度冷卻可以大大減少冷卻過程中對(duì)細(xì)胞的損傷。目前，實(shí)驗(yàn)室常用的梯度冷卻方法如下：
凍存管置于4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小時(shí)（或過夜，最長(zhǎng)放置時(shí)間不要超過一個(gè)月）→ 轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
*細(xì)胞置于4℃及-20℃的時(shí)間不可太長(zhǎng)，且從4℃轉(zhuǎn)移至-20℃時(shí)，最好顛倒混勻下細(xì)胞，防止細(xì)胞大量沉降堆積至管底，影響細(xì)胞復(fù)蘇。
利用介質(zhì)特性或制冷程序進(jìn)行獨(dú)立梯度冷卻：
將冷凍管放入細(xì)胞冷凍箱內(nèi)（冷凍箱內(nèi)需提前預(yù)冷至4℃，并檢查箱內(nèi)異丙醇或其他液體是否充足），然后將其置于-80℃冰箱中16-18小時(shí)（或過夜，最長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間不應(yīng)超過一個(gè)月）→ 將其轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
將低溫保存管放入低溫鏡中，以1-2℃/min的冷卻速度下降至-100℃→ 將其轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存
液氮（Liquid nitrogen）是液化的氮?dú)?，是生命科學(xué)研究和醫(yī)藥行業(yè)常用的冷凍儲(chǔ)存介質(zhì)，具有以下理化性質(zhì)：
01
超低溫性：液氮的沸點(diǎn)為－195．8，液氮?dú)饣瘯r(shí)每公斤可吸熱 48 大卡；
02
無色、無臭、無毒的液體；
03
窒息性：氮?dú)獗旧聿荒苤率谷酥舷ⅲ谝欢臻g內(nèi)，如果氮?dú)膺^多而隔絕氧氣，操作者也會(huì)引起窒息。
因而，在操作液氮罐時(shí)，需要注意以下安全使用規(guī)范：
防止凍傷。雖然它滲透性很弱，但當(dāng)人體皮膚接觸液氮時(shí)會(huì)受到嚴(yán)重凍傷。在放置細(xì)胞時(shí)，一定要確保穿戴了厚手套、護(hù)目鏡、實(shí)驗(yàn)服；
盡可能地快速操作。由于液氮在空氣中會(huì)迅速吸熱氣化，為了避免樣品溫度變化影響其質(zhì)量，需盡快操作；
做好維護(hù)。定時(shí)查看液氮余量，確保罐內(nèi)液體高度沒過重要樣品，最少時(shí)，液氮不可少于罐體容積的三分之一。
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